После нескольких лет работы в других французских лабораториях Н.Ф. Гамалея в 1892 г. окончательно возвращается в Россию, что открывает новую страницу в его научной и организационной деятельности. Первоначально он принимает предложение директора терапевтической клиники Военно-медицинской академии профессора Ф.И. Пастернацкого устроить при этой клинике бактериологическую лабораторию. В Санкт-Петербурге Гамалея защищает и свою докторскую диссертацию «Этиология холеры с точки зрения экспериментальной патологии». В 1896 г. он переезжает в Одессу, где продолжает исследования холерного токсина, много сил и времени уделяет вопросам практической борьбы с эпидемиями холеры и чумы. С 1912 г. работает в Оспопрививательном институте в Санкт-Петербурге.
Важную роль Н.Ф. Гамалея сыграл и как организатор науки. Испытывая сложности с финансированием своей деятельности, бактериологические станции и институты опирались на поддержку, получаемую из различных источников, – ассигнования земства, помощь частных меценатов, общественных организаций, университетов, высоко ценя живую связь с общественностью и независимость от государства и правительства. Бактериологические институты и лаборатории координировали свою деятельность в рамках объединявшего русских врачей Пироговского общества и его постоянно действующих комиссий. Однако в отличие от большинства других видных бактериологов Гамалея считался и с возможностью получения поддержки непосредственно от правительства, хотя и выступал против удушающего контроля профессиональной бюрократии. В предреволюционные годы он сотрудничает с Медицинским Советом МВД, участвует в возглавляемой Г.Е. Рейном Межведомственной комиссии по пересмотру врачебно-санитарного законодательства, выдвинувшей план создания Главного управления общественного здравоохранения – своего рода прообраза государственного министерства. Надежда на поддержку государства, доверяющего компетентным экспертам, позднее обусловила решение уже целого ряда бактериологов – Л.А. Тарасевича, Н.Ф. Гамалеи, П.Н. Диатроптова – сотрудничать с большевистским правительством, а также предопределила их ключевую роль в организации в 1918 г. Народного комиссариата здравоохранения и его важнейших учреждений.
В 1930 г. Гамалея переезжает из Ленинграда в Москву, выступая отныне в роли научного руководителя Центрального института эпидемиологии и бактериологии. В это же время в Советском Союзе начинаются репрессии против «вредителей» – научных и технических специалистов – особенно губительные для работающих в разных частях страны бактериологов, которых в массовом порядке обвиняют в отравлении воды и пищи, в преднамеренном распространении заразных болезней. Две волны репрессий – в начале 1930-х и в 1937–1938 гг. – уносят жизни как рядовых работников, так и специалистов, составляющих гордость отечественной науки – С.В. Коршуна, В.А. Барыкина, И.Л. Кричевского; однако гонения эти каким-то чудом обходят стороной Гамалею. В 1939 г. его избирают членом-корреспондентом, а в 1940 г. – почётным академиком АН СССР.
